张初署1,周海翔1,唐月异1,曹世宁1,王 冕1,陈 静1,于 强2,杨 珍1,张建成1*
(1.山东省花生研究所/农业农村部花生生物学与遗传育种重点实验室,山东 青岛266100;2.青岛天祥食品集团,山东 平度266737)
摘要:花生红衣富含原花青素等有益健康成分,但口感苦涩,限制了其在食品中的应用。 乳酸菌发酵能显著改善花生红衣口感,发酵后的花生红衣饮料富含原花青素和益生菌等有益成分,酸甜适口、风味独特。 本研究采用乳酸菌发酵花生红衣提取物,通过单因素试验和响应面法优化了发酵工艺条件。 试验结果显示,较优的发酵条件为料液比1:130、乳酸菌添加量为0.79%、白糖添加量为11.0%,p H值为6.32±0.04,发酵时间为8.4h,发酵液的感官评分为97.00±0.76。 该研究首次利用乳酸菌发酵花生红衣饮料,为提高花生红衣的利用率、拓宽其应用范围提供了技术支持。
关键词:花生红衣;乳酸菌;发酵;饮料;原花青素
花生红衣为花生(Arachishypogaea L.)的种皮,花生红衣中含有丰富的多酚类物质如原花青素,原花青素具有清除自由基、抗氧化及保护心血管、美容、抗衰老等作用[1-6] ,但花生红衣有很强的涩味,除少数被用于动物饲料与制药外,其余多被作为废弃物处理,造成了极大的资源浪费和环境污染[5]。 由于口感影响,当动物采食含有花生红衣的饲料时会导致釆食量下降[6]。目前市售的花生红衣药品主要是采用片剂或复配口服液的方式来降低或掩盖花生红衣口感。改善花生红衣的口感,提高消费者接受程度,对于促进花生红衣食品的开发具有重要意义[7-8]。乳酸菌是食品和饮料工业中常用的功能性发酵剂,乳酸菌发酵可以帮助人体消化,是益生菌的重要组成部分。 添加乳酸菌食品有益健康,能提高免疫力,降低血清胆固醇水平,维持肠道微生态平衡,降低癌症发生风险[9] ,同时抑制有害肠道细菌的生长和繁殖[10]。 乳酸菌发酵还能提高食品的营养功能,有证据表明,乳酸菌发酵可以增加多酚的生物利用度和食品的营养功效[11],比如,乳酸菌可以产生糖基水解酶,通过释放乙二醇结合糖苷中的糖苷配体来进行多酚的生物转化[12-13]。Gao等选择植物乳杆菌进行发酵,改善了果汁的香气分布,通过降低醛和酮的含量,增加醇和酸的含量,使发酵果汁具有更好的口感[14] 。 同时乳酸菌发酵显著改变了代谢物谱,如有机酸、糖和其他风味代谢物,这可能对蔬菜和水果的感官品质产生有益的影响[15-16]。
本研究采用花生红衣提取物作为原料,通过乳酸菌进行发酵并优化发酵工艺和产品配方,得到乳酸菌发酵花生红衣饮料的优化工艺条件,为研制花生红衣饮料、拓宽花生红衣的应用范围、提高其利用率提供了新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
花生红衣(安徽锦玉堂药业有限公司);乳酸菌(1010cfu/g,北京川秀 国际贸易有限 公 司);白糖(广州福正东海食品有限公司);原花青素标准品(纯度≥98%,上海融禾医药科技有限公司);纯净水;其他试剂(均为分析纯)。
1.2 试验方法
1.2.1 花生红衣提取物的制备
将100g花生衣粉碎,过40目筛,加入40%的乙醇溶液2500m L,在微波萃取仪中萃取90s(输出功率为600W、40℃),过滤,浓缩;将浓缩液采用AB-8大孔吸附树脂进行纯化,纯化条件为:上柱液流速为1m L/min,样品浓度为10mg/m L,解吸剂为65%的乙醇溶液,流速1m L/min;收集洗脱液,浓缩,干燥,得到花生红衣提取物[17-18] 。
1.2.2 乳酸菌发酵花生红衣饮料工艺优化
(1) 采用单因素试验。 准确称取0.1g花生红衣原花青素提取物,加入一定量的纯净水和白糖,均质5min,121℃高压蒸汽灭菌15min;加入一定量乳酸菌,一定温度下静置发酵一定时间。以发酵后花生红衣提取液口感得分,测定原花青素含量及p H为评定指标,考察不同因素对发酵效果的影响(表1)。 对照为花生红衣提取物溶液不添加乳酸菌,进行上述相同的操作,每个处理重复三次。
(2) 发酵工艺响应面优化。
在单因素试验的基础上,对花生红衣饮料感官品质有影响的五个因素进行响应面优化,优化发酵工艺。
1.2.3 测定方法
(1) 花生红衣饮料感官评价。 选用10位消费者,消费者身体健康,5男5女,年龄在20~40岁,分别对花生红衣发酵液的口感依据表2的标准评分,取10位评价者的平均得分为最终得分。(2) 原花青素的测定方法。 采用香草醛—盐酸法测定提取液中的原花青素。 取样液1.0 m L放入试管中,加入40g/L香草醛-甲醇溶液3.0m L混合,再加入1.5 m L浓盐酸(36%~38%),立即混匀。 室温下显色15 min左右,在500nm波长下测定吸光值,以40g/L香草醛-甲醇溶液做空白对照[17]。
(3)p H值测定。 采用p H计测定。
(4)HPLC色谱条件。 色谱柱为Agilen C81柱(4.6mm×150mm,5μm),流动相0.1%磷酸(A)和乙腈(B),检测波长230nm,柱温30 ℃;进样量10μL;流速0.8 m L/min;梯度洗脱:0~7min,85% A,15% B;7~17min,70%~85% A,30%~15% B;17~27 min,51%~70% A,49%~30% B;27~30 min,45%~51% A,55% ~49% B;30~35 min,30%~45% A,70%~55%B;35~40min,30%~85%A,70%~15% B;40~45min,85% A,15% B。
1.3 数据处理方法
利用Excel2010和SPSS20.0软件进行数据处理和统计分析。
2 结果与分析
2.1 料液比对乳酸菌发酵花生红衣饮料的影响
研究了不同料液比对花生红衣乳酸菌发酵饮料的影响,结果见图1。 乳酸菌发酵能够明显改善花生红衣提取液的感官评分,与对照相比,不同料液比条件下乳酸菌发酵花生红衣饮料感官得分都明显高于对照,在料液比为1∶110时,感官得分最高(图1A)。 发酵前后花生红衣溶液原花青素含量未见有明显变化(图1B),p H值随着加水量增加而下降(图1C)。 由此得出,适宜的料液比为1∶110。
2.2 乳酸菌添加量对发酵花生红衣饮料的影响
图2A可看出,添加乳酸菌能显著提高发酵液的感官得分,说明乳酸菌发酵能改善花生红衣溶液的滋味品质。 随着乳酸菌添加量的增加,感官评分先缓慢增长,在添加量0.7%~0.9%之间增长显著,之后略有下降。 发酵液中原花青素浓度随菌剂添加量的增加未见有显著变化(图2B)。
由图2C可看出,p H值随着菌剂添加量的增加呈显著下降趋势,在0.9%时达到最低,之后变化不显著,因此,较优的菌剂接种量为0.9%。
2.3 白糖添加量对发酵花生红衣饮料的影响
图3A可看出,随着白糖添加量的增加,感官评分先增加后降低,当白糖添加量超过10%时,由于菌剂接种量和发酵时间一定,此时乳酸生成量趋于饱和,产品甜度上升,导致感官评分下降。发酵液中原花青素浓度与对照相比未见有显著变化(图3B)。 图3C可看出,p H值随白糖添加量增加而显著下降,其原因为白糖添加量增加有利于乳酸菌的发酵,而乳酸菌发酵能产生大量乳酸,从而使发酵液的p H值下降。 通过感官、p H值的综合评价,适宜的白糖添加量为10%。
2.4 发酵温度对乳酸菌发酵花生红衣饮料的影响
图4A可看出,在36~44 ℃范围内,花生红衣发酵液感官评分随发酵温度的变化略有变化,在42 ℃时感官得分最高。 发酵前后原花青素含量没有显著变化(图4B),同时随发酵温度变化,发酵液p H值的变化也并不明显(图4B),因此,在后续的响应面优化中,固定发酵温度为42℃。
2.5 发酵时间对乳酸菌发酵花生红衣饮料的影响
图5A可见,随着发酵时间增加,感官得分先增加后下降,在发酵时间为8h时达到最高,之后显著下降。 发酵液中原花青素浓度随发酵时间的变化并未有显著变化(图5B)。 图5C可见,p H值随发酵时间的增加呈显著下降趋势,原因是随发酵时间增加,发酵产物中乳酸含量也随之增加,故p H值显著下降。 综上所述,适宜发酵时间为8h。
2.6 响应面优化
采用Box-Behnken中心组合试验设计原理,结合单因素试验结果,固定发酵温度为42 ℃,考察料液比(A)、乳酸菌用量(B)、白糖用量(C)和发酵时间(D)对发酵花生红衣感官(Y)的影响,试验设计与结果见表3。
2.6.1 模型的建立及其显著性检验
根据试验数据,利用Design-Expert8.0软件进行二次多项式回归拟合,回归方程为:Y= 88.8+2.17A-1.75B+0.76C-0.083D-0.5AB+1.5AC+1.0BC+1.75BD+2.0CD+4.97A2+1.1B2-0.025C2-0.9D2
通过Design-Expert软件进行方差分析来验证回归模型及各参数的显著度,结果见表4。
由方差分析可看出,模型P 值小于0.01,表明该模型方程极显著,不同处理间的差异高度显著;模型失拟项的P 值为0.2693>0.05,模型失拟项不显著,说明模型选择合适,且模型R2 95.21%,大于90%,说明模型拟合程度良好,试验误差小,该模型是合适的;变异系数反映模型的置信度,变异系数越低,模型的置信度越好,本试验变异系数为1.2%,说明模型方程能很好反应真实的试验值。因此可用该模型方程来分析和预测乳酸菌发酵花生红衣饮料的感官品质变化。 由表4的P 值可知道,方程中 A、B、BD、CD 对Y 值的影响极显著,C 和AC 对Y 值的影响显著,表明试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系,交互项和二次项也有显著影响。
2.6.2 响应面优化结果分析
根据回归分析结果做模型响应面和等高线图(图6)。 由图6A可见,乳酸菌的添加量处于较低水平时,发酵液感官评分随料液比的增加而增加,但当乳酸菌的添加量处于高水平时,发酵液感官评分随料液 比 的 增 加 而 先 降 低 后 增 加;由 图6B可见,乳酸菌的添加量处于中间水平,随发酵时间的增加,感官评分呈现先增加后减少;但当乳酸菌的添加量处于高水平时,随发酵时间的增加感官评分逐步增加;而图6C表明,白糖添加量处于低响应面横坐标中的-1~1代表归一化变量水平。
Note:-1~1ofabscissaerepresentthelevelofnormalizedvariablesoftestfactors水平时,感官评分随发酵时 间的增加而增加,当白糖添加 量 处 于 高 水 平 时,感 官 评 分 随 发 酵 时间的增加而降低。进一步用Design-Expert软件对试验模型进行典型性分析,以获得最优的提取条件。
经分析,在 A=1.0、B=-0.57、C= 0.57、D=0.19,即在料液比为1∶130、乳酸菌添加量为0.786%、白糖添加量为11.14%,发酵时间为8.38h时得到理论最大值(感官评分)为98.4。
2.6.3 模型验证为验证
响应面模型的可行性,采用得到的最佳发酵条件进行乳酸菌发酵花生红衣溶液,同时考虑到实际操作和生产的便利性,将发酵条件修正为料液比为1∶130、乳酸菌添加量为0.79%、白糖添加量为11.0%,发酵时间8.4h。
三次平行试验得到的实际平均值(感 官评分)为97.00±0.76,与理论值相差1.42%,发酵液p H值为6.32±0.04,表明响应面法对乳酸菌发酵花生红衣的优化是可行的,得到的发酵工艺条件具有实际应用价值。
2.7 乳酸菌发酵对花生红衣原花青素成分及结构影响的初步研究
花生红衣提取物主要成分是原花青素,且乳酸菌发酵能显著改善花生红衣提取物的滋味品质,利用HPLC测定发酵过程对花生红衣原花青素的影响,同时以花生红衣原花青素和乳酸菌溶液做对照,初步探究乳酸菌发酵改善花生红衣提取物滋味品质的机理。 由图7可看出,乳酸菌发酵花生红衣原花青素的HPLC图和花生红衣原花青素的HPLC图基本一致,说明乳酸菌发酵并未对原花青素含量和结构产生显著影响。 花生红衣原花青素具有很强涩味,乳酸菌发酵能显著改善其口感,但其结构或者含量并未发生改变,其具体原因需要进一步研究和探讨。
3 讨论与结论
乳酸菌发酵花生红衣原花青素的过程中,乳酸菌与原花青素相互作用,相互影响。 乳酸菌发酵能明显改善花生红 衣原花青素溶液的滋味品质;原花青素具有一定的抑菌作用,低浓度的原花青素有利于乳酸菌的生长,较高浓度的原花青素对乳酸菌有一定的抑制作用[19-20]。 本 试验中随着加水量增加,发酵液的p H值显著下降,说明加水量的增加使原花青素浓度降低,有利于乳酸菌的生长和繁殖。 菌种添加量和白糖添加量也显著影响乳酸菌对花生红衣原花青素的发酵,乳酸菌发酵将饮料中的糖分生成乳酸[21],当菌种添加量增大时,乳酸产量也随之増多,对发酵液的感官也有一定影响。随着乳酸菌添加量的增加,发酵液的口感明显改善,原因是发酵产生的乳酸或其他代谢产物会降低原花青素的涩味,但乳酸浓度过高时则会导致产品感官品质下降。
随着白糖添加量増加,有利于乳酸菌发酵[22] ,同时产品甜度上升,感官评分不断升高;当白糖添加量过大时,乳酸菌不能充分利用,产品甜度上升,导致感官评分下降。采用乳酸菌对花生红衣提取物进行发酵,通过单因素试验和响应面优化得到发酵花生红衣饮料的加工工艺。
试验结果显示,料液比、乳酸菌添加量以及白糖添加量对发酵花生红衣溶液口感影响显著,优化的发酵条件为:料液比1∶130、乳酸菌添加量0.79%、白糖添加量11.0%、发酵时间8.4h,发酵液的感官评分97.00±0.76,p H值6.32±0.04。开发的花生红衣饮料口感较好,富含原花青素和益生菌等有益成分,澄清透明,风味独特。
本研究可为花生红衣的增值利用提供新的途径,为花生红衣产品开发提供新的思路,并希望为后期进一步研究乳酸菌发酵对花生红衣饮料中营养成分及感官的变化机理研究提供技术支持。