高晓雪*，王刚，宫建辉，夏新月，董彦博
北京姿美堂生物技术股份有限公司（北京 100144）
摘 要 为建立适合氨糖软骨素奶粉中测定硫酸软骨素的方法, 根据保健食品法规、国家标准及产品原辅料组成确定该产品中硫酸软骨素的测定方法。以戊烷磺酸钠溶液为流动相A, 乙腈为流动相B, 梯度洗脱, Nncleodur C18 (用极性小分子封尾, 250 mm×4.6 mm, 5 μm) 为色谱柱, 进样量10 μL, 流速0.8 m L/min, 在192 nm波长下对氨糖软骨素奶粉中硫酸软骨素含量进行检测。结果表明: 硫酸软骨素在100.29~1 002.9 μg/m L范围内与峰面积呈良好的线性关系, R2=0.999 6; 硫酸软骨素检出限和定量限分别为1.50 μg/m L和16.23 μg/m L, 3个浓度水平的加标回收率为99.95% (SRSD=2.76%)。6批样品中, 硫酸软骨素含量为1.91~2.05 g/100 g。该方法操作简单、线性关系好、准确度高、精密度、回收率等良好, 可用于氨糖软骨素奶粉中硫酸软骨素的质量控制。
关键词 硫酸软骨素; 氨糖软骨素奶粉; 测定方法
Determination of Chondroitin Sulfate in Aminochondroitin Milk Powder by HPLC
GAO Xiaoxue*, WANG Gang, GONG Jianhui, XIA Xinyue, DONG Yanbo
Beijing Zimeitang Biotechnology Corporation (Beijing 100144)
Abstract In order to establish a suitable method for the determination of chondroitin sulfate in aminochondroitin milk powder, the determination method of chondroitin sulfate in the product was determined according to health food regulations, national standards and the composition of raw materials. Sodium pentanesulfonic acid solution was used as mobile phase A, acetonitrile as mobile phase B, gradient elution, Nncleodur C18 (tail sealed with polar small molecules, 250 mm×4.6 mm, 5 um) was used as the chromatographic column, the sample size was 10 μL, and the fiow rate was 0.8 m L/min. The content of chondroitin sulfate in ammoniated chondroitin milk powder was detected at 192 nm wavelength. The results showed that chondroitin sulfate had a good linear relationship with peak area in the range of 100.29-1 002.9 μg/m L, R2=0.999 6; The limits of detection and quantifcation of chondroitin sulfate were 1.50 μg/m L and 16.23 μg/m L, respectively. The recoveries of the three concentrations were 99.95% (SRSD=2.76%). The contents of chondroitin sulfate in 6 batches of samples ranged from 1.91 g/100 g to 2.05 g/100 g. The method had the advantages of simple operation, good linear relationship, high accuracy, precision and good recovery rate. It could be used for the quality control of chondroitin sulfate in aminochondroitin milk powder.
Keywords chondroitin sulfate; gummy chondroitin collagen calcium milk powder; determination method
硫酸软骨素（chondroitiulfate，CS）作为一种具有天然活性的酸性黏多糖类物质，其广泛存在于动物的软骨和结缔组织中[1]。在临床应用当中其具有调节血脂、抗肿瘤、抗衰老、治疗关节炎、防治冠心病等多种疗效，并且不良反应少[2-5]。此外，硫酸软骨素被广泛应用于食品及化妆品中，还具有改善口感、润滑度、吸湿性等作用[2-7]。因此，测定CS含量的分析方法对于保健食品和药品原料及成品销售的品质控制非常重要。
硫酸软骨素是由D-葡糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖以β-1, 4-糖苷键连接而成的重复二糖单位组成的多糖。测定CS含量的常用方法有分光光度法、高效液相法和电化学分析法等[1-6]。分光光度法主要是通过利用分光光度仪测定二糖在特定条件下与试剂反应生成有色物质或沉淀。但由于糖胺聚糖的结构相似度高，且软骨中富含多种黏多糖，干扰因素多，那么重现性差，而且该方法需要使用毒性较强的试剂，存在潜在危害[2, 4]。电化学分析法对操作人员试验素质要求高，且试验条件要求严格，专属性比较强[6]。高效液相法主要是将多糖分解后进入色谱柱利用各组分间极性差异的性质进行分离后检测，该方法测定对象单一，无杂质干扰，灵敏度高，适用性广。已有的GB/T 20365—2006《硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖含量的测定 液相色谱法》是通过用液相色谱测定硫酸软骨素的方法[2-3, 7-9]。
试验测试品选择氨糖软骨素奶粉，含有大量CS，除此之外还含有其他食品成分，对测定会有较大干扰。因此，有必要建立可快速准确测定氨糖软骨素奶粉中硫酸软骨素含量的方法。试验以氨糖软骨素奶粉为测试品，利用高效液相色谱仪，通过优化提取方法、流动相流速等色谱条件建立同时测定氨糖软骨素奶粉中CS含量的方法，并完成方法学验证，以期更好地用于氨糖软骨素奶粉的质量控制。
1 仪器与试剂
1.1 仪器与设备
高效液相色谱仪[岛津仪器（苏州）有限公司]；电子天平（d=0.01 mg，株式会社岛津制作所日本京都）；电子天平[d=0.1 mg，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。
1.2 材料与试剂
硫酸软骨素钠（批号140792-202003，中国食品药品检定研究院）；D-盐酸氨基葡萄糖（批号140649-201606，中国食品药品检定研究院）；无水乙醇（批号20201109，天津市津东天正精细化学试剂厂）；戊烷磺酸钠（批号20180761，MREDA）；乙腈（批号021902，MREDA）；氯化钠（批号20190818，北京市红星化工厂）；中性氧化酶（批号515E011，Solarbio）；磷酸二氢钾（批号20180117，北京化工厂）；氢氧化钠（批号20170104，北京化工厂）；氨糖软骨素奶粉（批号20220101，北京姿美堂生物技术股份有限公司）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Nncleodur C18（用极性小分子封尾，250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为戊烷磺酸钠溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱，流速0.8 m L/min，柱温35 ℃，检测波长192 nm时，进样量10 μL。
2.1.1 流动相优化
为改善峰形、提高测定结果的准确性、保证成品质量，对GB/T 20365—2006《硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖含量的测定 液相色谱法》规定的方法中的试样流动相进行优化，表1中序号1的流动相比例为国标规定的色谱相方法。由表1和图1可知，根据不同流动相色谱条件下硫酸软骨素峰形及分离度，确定流动相为乙腈+戊烷磺酸钠2+98（V/V），其他色谱条件不变。在此条件下，色谱峰形、分离度会比较好。
2.2 溶液的制备
2.2.1 供试品溶液
将5 mg样品溶解在10 m L水中，通过水超声提取20 min；提取液使用微孔滤膜按10 000 r/min离心，摇匀，滤过，取续滤液。
2.2.2 对照品溶液制备
称取25.48 mg硫酸软骨素钠对照品于25 m L容量瓶中，加适量水超声溶解，加水定刻度，作为对照品储备液。量取5 m L对照品储备液于10 m L容量瓶中，加水定容至刻度，为对照品使用液。
2.2.3 阴性对照溶液
按供试品的处方工艺和配方比例制得缺硫酸软骨素的阴性样品。
2.3 线性关系考察
称取25.48 mg硫酸软骨素对照品，按照2.2.2的方法制备对照品储备液，依次量取1，2，3，4和5 m L对照品储备液于10 m L容量瓶中，加水定容至刻度，作为对照品标准工作液标准曲线。按照该试验优化好的流动相色谱条件方法下测定，用峰面积（Y）对浓度（X）绘制硫酸软骨素的标准回归曲线。如表2和图2所示。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验
精确称取样品，按2.2.2的方法制备供试品，按2.1.1的优化后得色谱条件平行测定6次，计算结果硫酸软骨素含量。表3测定结果表明，硫酸软骨素的平均值（n=6）分别为2.03 g/100g，SRSD为0.81%，表明该法精密度良好。
2.4.2 稳定性试验
取样品，按2.2.1的方法制备供试品溶液，室温放置0，2，4，6，8，10和12 h，按照2.1色谱条件测定，记录硫酸软骨素含量，SRSD为0.8%，表明该法重复性良好，表明供试品溶液在室温12 h内稳定性良好。
2.4.3 重复性试验
取样品6份，分别按2.2.1的方法制备供试品溶液，按照2.1的色谱条件测定，硫酸软骨素含量1.98 g/100 g，SRSD分别为3.7%。
2.4.4 回收率试验
平行分别称取6份的样品，各加入硫酸软骨素钠标准品（纯度98.4%）约12.8 mg，加入25 m L水，超声20 min，按10 000 r/min离心10 min，取1 m L上微孔滤膜（3 000道尔顿），按10 000 r/min离心30 min，下清液弃去；在微孔滤膜上加入2.0 m L水，按10 000 r/min离心30 min，精确加入2.0 m L水，超声5 min，取出过0.45 μm滤膜。按照2.1.1的色谱条件进行测定，并计算硫酸软骨素的加样回收率，结果见表4。
2.4.5 检出限和定量限
取2.3的最低浓度的混合对照品溶液，用水逐步稀释并进行测定，分别按2.1.1的色谱条件进行测定，记录信号强度与噪音强度的比值，将信号强度和噪音强度之比约为3倍信噪比和10倍信噪比作为检出限和定量限，硫酸软骨素的检出限为1.50 μg/m L，定量限为16.23 μg/m L。结果表明，试验方法测得的方法检出限和方法定量限均小于标准规定的检出限和定量限，试验方法测定硫酸软骨素的灵敏度较高，能够满足含量测定的需要。
2.4.6 样品含量测定
取4批次样品，分别按2.2.1的方法制备供试品溶液，每批平行3份，按2.1.1的色谱条件测定，记录峰面积，按外标法计算硫酸软骨素含量，结果见表5。
3 结论与讨论
3.1 供试品处理方法的优化
试验根据硫酸软骨素的理化性质，分别考察不同提取溶剂（水、不同比例乙腈-水）、提取方法（超声、酶解）。结果表明：水作为提取溶剂时，硫酸软骨素的峰形较好；超声成分含量影响无显著性差异，并且超声提取法提取效率高，时间短，操作简单，被广泛用于供试品溶液的制备。最终确定：采用水超声提取20 min；提取液使用微孔滤膜（3 000道尔顿）10 000 r/min离心作为提取条件。
3.2 色谱条件的选择
由于硫酸软骨素的检测波长为192 nm，而甲醇在低波长处有较高的紫外吸收值，因此采用乙腈作为有机相。试验考察不同比例的乙腈-戊烷磺酸钠溶液作为流动相，发现流动相为乙腈-戊烷磺酸钠2+98（V/V）作为流动相系统，梯度洗脱时分离效果最佳，且可改善峰形。
3.3 对建立方法的总体评价
试验采用HPLC梯度洗脱-波长切换法对氨糖软骨素奶粉中的硫酸软骨素进行含量测定，相比现行标准，影响因素少，且能真实反映硫酸软骨素含量，对氨糖软骨素奶粉的质量控制有一定参考价值。